Efecto del TENS en la angiogénesis y contracción de heridas escisionales agudas en ratas

Ultima edición: Noviembre 15, 2023, 03:44 Hrs

En la actualidad el TENS es una de las corrientes más utilizadas en la fisioterapia para producir analgesia pero hoy en día se tiene muy poca evidencia de su uso en distintos ámbitos. Este hecho ha impulsado el desarrollo de investigaciones que exploren la efectividad de estas corrientes en aplicaciones diferentes a las convencionales.

Una de estas investigaciones se publicó en un artículo desarrollado en el año 2017 por Aline Fernanda Perez Machado y colaboradores, en el cual se desarrolla una investigación en ratas para analizar los efectos de angiogénesis y contracción de heridas utilizando TENS, después de realizar heridas escisionales en la piel de las ratas. El objetivo de este estudio es el poder determinar la eficacia del TENS sobre la angiogénesis y contracción de heridas según los resultados obtenidos durante y después de realizar la intervención en los animales.

Principios generales del TENS

Consiste en la aplicación de corrientes eléctricas pulsadas, transmitidas por electrodos a través de la superficie intacta de la piel para estimular los nervios periféricos, produciendo diversos efectos fisiológicos. El TENS puede aplicarse usando diferentes ondas y una amplia gama de parámetros de estimulación eléctrica. Es ampliamente utilizado en la práctica clínica para promover la analgesia, sin embargo, algunos autores han observado que el TENS también promueve alteraciones en la piel temperatura, aumentos en el flujo sanguíneo local y la liberación de neuropéptidos vasodilatadores y factores de crecimiento. Estos eventos pueden estar relacionados con los efectos positivos de TENS en la curación de heridas y en la viabilidad de colgajos de piel.

Se ha demostrado que el factor de crecimiento epidérmico (EGF) puede ser estimulado por estimulación nerviosa transcutánea (TENS) aumentando la síntesis y concentración de factores de crecimiento en dermis y epidermis, lo que podría llevar a nuevos enfoques terapéuticos combinando.

Diseño del estudio

Consistió en un estudio experimental, aleatorizado, controlado y ciego. La muestra consistió en 54 machos, ratas adultas jóvenes cuya raza fue rattus norvegicus albinus obtenidas de la cepa Wistar-EPM 1, con una edad media de 45 días y un peso de entre 250 y 350 gramos. El estudio comenzó después de la aprobación del Comité de Ética en Investigación de la Universidad Federal de São Paulo (UNIFESP), con número de autorización 1491/10.

Los animales se alojaron en jaulas individuales de polipropileno con acceso libre al agua y alimento, en un ambiente controlado de acuerdo con los estándares del Colegio Brasileño de Experimentación Animal (COBEA).

Muestra

El número de animales requerido se determinó mediante el cálculo de la muestra con una diferencia promedio de 0.3 mm² (± 0.1) esperada, según el estudio de Garros et al. El índice de significación estadística fue del 5% y la potencia de la muestra del 80%, con 4 animales en cada subgrupo, considerado el número mínimo de representatividad estadística. Sin embargo, considerando la posibilidad de alguna pérdida, se agregaron dos animales por subgrupo, totalizando 6 ratas, para evitar posibles variables que pudieran interferir con el poder estadístico.

Los animales fueron asignados aleatoriamente mediante la implementación de un programa online llamado randomization (www.randomization.com) la división se dio en tres grupos:

Grupo de alta frecuencia (HG / n=18)
Grupo de baja frecuencia (LG / n=18)
Grupo simulado (SG / n=18)

Cada grupo se dividió en tres subgrupos (n=6) según los días postoperatorios (PO): 3, 7 y 14 días. El cegamiento de la asignación se mantuvo usando sobres opacos y sellados.

Inicialmente los grupos HG y LG fueron sometidos a la prueba usando un TENS convencional con las siguientes dosificaciones:

Duración de pulso (T): 200 microsegundos (?s)
Amplitud (I): 15 miliamperios (mA)
Tiempo: 15 minutos (min)

Posteriormente la duración de la aplicación tuvo una duración de 60 min, por 3 días consecutivos con las siguientes dosificaciones:

Frecuencia (f) para HG: 80 Hertz (Hz)
Frecuencia para LG: 5Hz
El SG fue sometido a la aplicación del TENS desconectado
Pulsátil
Bifásico
Ondas rectangulares simétricas

Al final de cada procedimiento, se administraron 5 miligramos por kilogramo (mg/kg) de peso corporal de 12mg de hidrocloruro de tramadol (Dorless V®) por vía oral a cada animal.

Técnica operacional

Los animales se anestesiaron con 0,2 mililitros (ml) de clorhidrato de ketamina al 10% (Ketamine Agener®) asociado con 0,1 ml de hidrocloruro de xilazina (Calmium®, Xylazine 2%), por vía intramuscular en el músculo gastrocnemio derecho. Con el animal anestesiado, la depilación se realizó mediante tracción manual del pelo de la región dorsal en un área de 6 cm (cráneo-caudal) de 5 cm de longitud (lateral-lateral), centralizada en la línea dorsal media, con un área total de 30 cm².

Para realizar la herida, se utilizó un punzón de metal estéril (Pet Medical®), de 8 mm de diámetro y profundidad, que incluía epidermis, dermis y pannus carnoso hasta la fascia superficial. Las heridas quirúrgicas no recibieron ningún tipo de cobertura y / o vendaje durante todo el período del experimento.

Equipo utilizado

La aplicación de la TENS se inició inmediatamente después del procedimiento quirúrgico y en los dos días posteriores. Todas las sesiones se llevaron a cabo a la misma hora del día. La emisión de TENS se realizó mediante un canal de salida con dos electrodos de carbono-silicio, midiendo 4,2 cm de longitud y 1,5 cm de ancho, colocado a 1 cm de los márgenes superior e inferior de la herida escisional, se utilizó gel de acoplamiento (Carbogel^®) y tiras de cinta adhesiva. El área total de cada electrodo era de 6,3 cm² y la densidad de corriente era de 2,38 mA/cm².

El TENS utilizado en este experimento fue un Orion Decenas^® (Orion Apparelhos para Fisioterapia LTDA; número de serie 00849, Campinas, São Paulo, Brasil), con pantalla digital. El estimulador eléctrico fue medido por un ingeniero y calibrado con un osciloscopio digital profesional, marca Minipa Mo-2050 (50MHz), antes del comienzo del experimento. Para cada pulso del dispositivo, el voltaje pico a pico se midió a través de una resistencia de 1 kilo-ohm (k?) para calcular la amplitud de la corriente en mA.

Evidencia en el análisis microscópico

Con los animales anestesiados, se recolectó una muestra de piel de la región dorsal correspondiente al área de la herida, con una estandarización de 2 mm en relación con los márgenes superior e inferior y 5 mm desde los márgenes laterales de la herida, totalizando un área variable de acuerdo con el día PO según el subgrupo en los respectivos días de sacrificio.

Las muestras se fijaron en formalina al 10% y se enviaron para su análisis. Los portaobjetos se desparafinaron en xylol, se hidrataron en baños de alcohol en disminución hasta agua desionizada, se tiñeron con Hematoxilina de Mayer, seguido de tinción con Eosin-Floxin. Luego fueron montados y analizados por un evaluador experimentado (patólogo vinculado a la Universidad Federal de São Paulo)

La hematoxilina eosina (HE) se usó como la forma para la medición de la angiogénesis del tejido cicatricial mediante la cuantificación de vasos neoformados, identificados por la presencia de células endoteliales más voluminosas en relación con los otros vasos.

El análisis de los portaobjetos se realizó en cada área de la herida. Debido a que la muestra de tejido tenía un tamaño variable según el área de la cicatriz, el tamaño de la lesión se condicionó al día postoperatorio (3, 7 y 14 días, subgrupos), y las muestras del tercer día postoperatorio fueron más grandes en comparación con las del 14^º día postoperatorio.

Las imágenes analizadas se obtuvieron usando una cámara fotográfica CoolSNAP-Procf de aumento 100x (objetivo 10x) marca Media Cybernetics Inc. Unida a un microscopio Nikon Eclipse-E800. Posteriormente, se cuantificó el área de cicatrización y el número de vasos neoformados con la ayuda del sistema de imagen computarizado Image-ProPlus, versión 4.5 marca Media Cybernetics Inc. Posteriormente, las áreas de la herida y los vasos sanguíneos se sometieron a una suma final por portaobjeto considerando toda la extensión de la herida. Así, el número de vasos por m² se obtuvo de tejido cicatrizal, y finalmente se calculó el número medio de vasos neoformados por subgrupos.

Evaluación fotográfica

Se realizaron imágenes fotográficas para obtener el área de la herida y para su aplicación en el porcentaje de fórmula de contracción de la herida, en el intervalo PO, 3, 7 y 14 días PO, antes del sacrificio indoloro de los animales. Las imágenes fotográficas se realizaron con una cámara digital Cyber-Shot de Sony^®, con una resolución de 14.1 megapíxeles. La estandarización de las imágenes siguió las especificaciones para garantizar los resultados obtenidos. La cámara digital se colocó sobre un trípode que mantenía una distancia estándar de 20 cm de la herida, con el animal posicionado en decúbito ventral, con las patas delanteras y traseras extendidas, con un fondo infinito de color azul cielo.

Para evaluar los resultados terapéuticos del TENS, se calcularon las variaciones del área de la herida, medidas cuantitativamente en los diferentes días del análisis, utilizando el software Image J, versión 1.44, marca Research Services Branch. Este análisis se realizó con las imágenes organizadas en orden cronológico y fue llevado a cabo por un evaluador experimentado que no sabía a qué grupo pertenecían los animales.

Con base en los valores del área de la herida se pudo calcular el porcentaje usando la siguiente formula:

% de contracción de herida = (área inicial ? área del día de análisis) / área inicial X 100

Según los ítems de esta fórmula, el "área inicial" en el intervalo de PO correspondía al área obtenida después del procedimiento operativo, calculada a partir de la fórmula:

· Área = ?. R²

o Donde ?=3.14 y R=0.8, equivalente al tamaño del punzón utilizado para realizar la herida

Por lo tanto, el valor del "área inicial" fue 0.5024. El "área del día de análisis" correspondía al área de la lesión previa a la eutanasia obtenida mediante el análisis con el software Image J.

A continuación, los animales fueron sometidos a eutanasia por sobredosis anestésica intraperitoneal, administrándose 500 mg / kg de clorhidrato de ketamina al 10% (Ketamine Agener®) con 250 mg / kg de hidrocloruro de xilacina (Calmium®, Xylazine al 2%), seguido por la sección de los grandes vasos cervicales.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos se analizaron usando GraphPad Prism® 6.0 para el software de Windows. Para verificar si los datos presentaban una distribución normal, se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk. Para la evaluación de la angiogénesis y el porcentaje de contracción de la herida, se utilizó el análisis de varianza (ANOVA), así como la prueba post hoc de Tukey. El nivel de significación adoptado para las pruebas estadísticas fue del 5% (p <0,05) y los valores se presentaron como media y desviación estándar (DE). El cálculo del tamaño de la muestra se realizó con el software Minitab 15.

Resultados

Los resultados obtenidos para la angiogénesis se muestran en la siguiente tabla:

ANOVA, post hoc de Tukey. PO=Postoperatorio. HG=Grupo de alta frecuencia. LG=Grupo de baja frecuencia. SG=Grupo simulado. SD=Desviación estándar. Valor P = Nivel de significancia. *=estadísticamente significativo. ? = Diferencia significativa de HG de LG y SG. ?=diferencia significativa de LG de HG y SG.

Los resultados para la contracción de la herida se muestran en la siguiente tabla:

ANOVA. HG=Grupo de alta frecuencia. LG=Grupo de baja frecuencia. SG=Grupo simulado. SD=Desviación estándar. Valor P=Nivel de significancia.

Conclusiones

Este es el primer estudio experimental para evaluar el efecto de la TENS de alta y baja frecuencia sobre la angiogénesis y la contracción de la herida escisional aguda en la piel de la rata a través del análisis microscópico con hematoxilina eosina (HE) y la evaluación fotográfica.

Se concluye que la estimulación nerviosa eléctrica transcutánea (TENS) de alta frecuencia estimula la angiogénesis debido a que la estimulación eléctrica libera el actor de crecimiento endotelial vascular, teniendo mayores resultado en el grupo HG en los 3 días PO, mientras que el grupo LG obtuvo mayores resultados a las 14 días PO, sin embargo, ninguna de las frecuencias influyó en la contracción de la herida escisional aguda en la piel de la rata debido a que el área de herida (8 mm) es demasiado pequeña para determinar las diferencias macroscópicas en la curación y para comparar los diferentes grupos (HG, LG y SG). Por lo tanto, el tamaño de la herida puede no haber proporcionado sensibilidad para demostrar los cambios reales.